脑缺血与凋亡相关基因的变化

毕业

脑缺血与凋亡相关基因的变化

曹阳

广州市红10字会医院

1般认为,脑损伤引起的急性期神经元死亡是以坏死为主,而继发死亡或迟发死亡则以凋亡为主,

大约有50%的细胞死亡是由凋亡引起.

前者发生在缺血后早期的中心区,后者多发生在缺血后的半影

区.细胞的凋亡与坏死其本质区别在于凋亡是1种主动死亡过程,伴随基因转录和蛋白质合成,特征

性变化是DNA的寡核小体间裂解,在凝胶电泳时呈现特征性的"DNA梯".

细胞凋亡的形态学特点是

细胞核染色质固缩,细胞膜发泡,细胞器紧缩,凋亡小体形成与呈现"DNA阶梯"电泳图谱.

细胞凋亡是机体在内外环境刺激下,启动自身机制,由基因调控的细胞死亡过程,需新的mRNA

表达和蛋白质合成过程.

细胞凋亡是1个瀑布式基因表达过程,许多基因包括原癌基因与抑癌基因均

参与细胞凋亡的调控,细胞凋亡过程中涉及某些基因的活化,并且受基因密码的调控,因此有人将此

种由遗传因素决定的细胞凋亡的基因称为"凋亡基因".

研究资料显示在脑缺血损伤中,神经元凋亡受到1系列基因的调控,脑缺血后有多种基因表达,

并编码蛋白质产物介导凋亡的调控,包括促进凋亡的Bax,Bcl-xS,Caspases家族,NFκB,P5

3,Fas/Fasl

等,以及抑制凋亡的Bcl-2,Bcl-xL,HSP,cFos,sFas等等.

2,研究较多的凋亡相关基因家族

1 半胱天冬酶Caspases家族

半胱天冬酶Caspases家族属于半胱氨酸蛋白酶家族.

目前研究较明确的Caspase家族成员有10

余个.主要分为2大类,1是调控细胞因子成熟,诱导炎症反应的白介素-1转换酶(interleukin-1

cinverting enzyme)家族,如Caspase-1,

4,5,11,12及14,等,另1类是直接参与凋亡的Caspase-2,

3,6,7,8,9等.

进1步可以分为起始 Caspases(initiator caspases)和效应Caspases(effector Caspases),

起始 Caspases有1个较长的前区,与位于跨膜和胞内触发凋亡的蛋白质的死亡结构域(the death

domains,DDs)起反应,并通过这1反应将1系列凋亡前刺激物激活,并使之具有蛋白分解活性;

而

效应Caspases有1个短的前区,直接参与细胞内底物分裂,导致凋亡细胞形态学和生化特征改变.

大

量证据表明脑缺血可以激活Caspases.神经元发生凋亡时Caspase-9被激活,并将 procaspase-3裂解,

产生具活性Caspase-3,进而酶解切割特异性底物PRAP [poly (ADP-ribose) polymerase],DNA依赖性

蛋白激酶(DNA-PK),类固醇调控元件结合蛋白(SREPB)等.

许多研究表明,Caspase-3是关键蛋

白酶,处于级联反应的核心位置并发挥重要作用,被称为死亡蛋白酶.

在实验性大鼠短暂性半球和全

脑缺血模型中,在神经细胞死亡之前就可以观察到Caspase-3 mRNA的上调和蛋白质激活,尤其是海

马和尾状核部位.

研究报道大鼠短暂全脑缺血可导致Caspase-3介导的ICAD(inhibitor of caspase-activated

deoxyribonu- clease)的分裂,产生CAD(caspase-activated deoxyribonuclease),进而DNA被CAD降

解,产生凋亡.相关报道大鼠短暂MCAO时,DNA酶活性可被具有抑制 Caspase-3活性的类似物所

抑制.

研究表明持续性局灶性脑缺血,可有Caspase前体(Caspase-3,

6,8)的mRNA和蛋白质水平

的增加,以及Caspase-3,8激活和PARP的分裂.

大鼠脑室内注射选择性Caspase阻滞剂2-DEVD-fmk

后,可减少细胞凋亡,具有神经保护作用.这表明 Caspase-3是促进脑缺血后神经元凋亡的1个重要

因素.另有报道动脉血栓栓塞性脑卒中患者发病数小时内,procaspase-3的水平有增加,但活性

Caspase-3和PARP碎片并未有明显增加.

在患者发生心脏缺血再灌注几天后,在部分神经元细胞内可

以检测到Caspase-3和89-kD的PARP分裂产物,表明Caspase-3可以导致神经元的迟发性死亡.

2 Bcl-2基因家族

Bcl-2 是从滤泡性淋巴细胞瘤中分离出来的1种癌基因.

Bcl-2 家族可以分为3组.

第1组包括

中华麻醉在线 *** 2007年9月

Bcl-2,Bcl-xL,A1/Bfl1,Boo/Diva,Bcl-w,Mcl-1及Nrf-3,均含有4个与 Bcl-2相同的区域(BH1-4),

即含有1个疏水的C末端,通过它与内质网,核膜及线粒体外膜相连.

第2和第3组则是凋亡前体(pro-

apoptotic),第2组C末端或者是缺乏BH4区 (Bax,Bak,Bok/Mtd)或者是具有BH4区,但缺乏BH1

和BH2区(Bcl-xS),第3组包括Bad,Bid,Bik/Nbk,Bim/Bod,Blk,Hrk,Nix,Bnip3,Noxa和

PUMA,只含有1个BH3区.Bcl-2在进化过程中高度保守,功能也相对保守,它通过阻断细胞凋亡

而促进细胞存活,维持细胞生存,而Bax与Bcl-2功能相反,诱导细胞凋亡.Bcl-2和Bax 的表达强

度决定细胞命运,Bax占优势时促进细胞死亡,Bcl-2占优势时阻止细胞死亡).Bcl-2抑制细胞凋亡的

机制可能在于其与凋亡促进基因Bax拮抗,抑制细胞色素C自线粒体释放至细胞质,阻止胞质内细胞

色素C对Caspase蛋白酶的激活,从而抑制凋亡.

研究发现,Bax基因是P53的下游基因,它单独不足以启动细胞凋亡途径,多与Bcl-2,P53共同

参与并调节细胞凋亡,其作用具有2重性,Bax不仅能和Bcl-2形成2聚体(Bcl-2-Bax)抑制凋亡,

而且其自身还能形成2聚体(Bax-Bax)诱导凋亡.Bcl-x有两种基因产物Bcl-xL和Bcl-xS,Bcl-xL

抑制凋亡,Bcl-xS拮抗Bcl-2和Bcl-xL的功能,促进细胞凋亡,两者在凋亡调控中的确切作用机制与

Bcl-2的关系尚未完全阐明.Bcl-2选择性与Bcl-xL2聚体,使得其与Bcl-2的亲和力变小,代替Bax

调节Bcl-xL的抗凋亡作用.

动物实验表明,短暂性局灶性脑缺血后20min海马CA1区Bcl-2的表达开始升高,3天达峰值,

可持续7天.

而在脑缺血后神经元细胞死亡之前,会出现Bax水平增高,同时在短暂性局灶性脑缺血

发生时,Bax可快速由胞浆转移至线粒体,与线粒体的腺嘌呤核甘酸异位子及电压依赖的阴离子通道

反应,促进细胞凋亡.在缺血再灌注损伤的动物模型中,Bcl-2过度表达可减少神经细胞凋亡,并可预

防海马CA1区齿状颗粒细胞凋亡.

而另1方面,敲除Bcl-2基因,则神经功能缺失增加,梗死面积扩

大.总之,在Bcl-2家族中,抑制凋亡组有Bcl-2,Bcl-xL,促进凋亡组有Bax,Bcl-xS,Bad等.

3 核转录因子NFκB

NFκB最初发现于B淋巴细胞,与免疫球蛋白的κ轻链基因增强子的B位点结合,调控免疫球

蛋白的κ轻链的转录,NFκB的活化受 IκB(inhibitor-κ-binding)调节,NFκB根据其活化状态分

为诱导型和结构型,诱导型指在 NFκB非活化状态下,与其抑制蛋白IκB结合,存在于细胞质内;

结构型是指活化后在核内无IκB,能与DNA结合的形式.

NFκB在CNS中广泛存在,可见于大脑

皮质,海马和小脑突触上,神经元,神经胶质细胞与血管内皮细胞均可表达,与CNS的信号传导有关.

NFκB是各种炎症因子的中间调控环节,在凋亡中的作用较为复杂,过度的表达导致各种损伤,完全

不表达则不利于自身保护.

研究表明,24h内的1过性NFκB活化,诱导神经元保护因子的表达,保

护缺血性脑损伤,而在海马神经元中的持续表达,可促使海马CA1区神经元死亡.

4热休克蛋白(heatshockprotein, HSP)

HSP是机体应激反应中产生的1组特殊蛋白质.

目前证实约有2百余种因素能刺激HSP的产生,

故又称应激蛋白.

HSP 主要功能是提高细胞对应激因素的耐受,维持细胞蛋白自稳,使细胞维持正常

的生理功能.研究较多的有 HSP70,HSP110, HSP7

2,HSP60等.研究发现,短暂脑缺血后,HSP70

等在脑缺血区明显升高,其早期表达是细胞耐受缺血性损害的原因之1.其作用机制可能是依赖ATP

恢复正常核糖体装配,促进新核糖体的合成及加速细胞核形态的恢复.

5 P53基因

P53 是促进细胞凋亡的重要基因,它通过激活1系列下游基因发挥促凋亡作用.P53作为1种抑

癌基因,其蛋白产物有野生型 (wt-P53)和突变型(mt-P53)两种.

mt-P53至今为止只在肿瘤细胞中发现,

与细胞的异常增殖有关;

wt-P53作为1种抗细胞增殖蛋白,可诱导肿瘤细胞和神经元凋亡.另外,wt-P53

作为1种转录调节因子,可调节其他细胞周期相关基因,如p21基因,Bax基因的表达,同时降低Bcl-2

的表达,加速细胞凋亡.

研究发现:大鼠大脑中动脉闭塞2h,再灌注6h时,神经元开始出现P53表

达,于再灌注12达高峰,随后下降,蛋白表达位于神经元严重受损的区域.

6 Fas/Fasl

Fas是人们在研究膜蛋白抗体的溶细胞作用时被发现,进而从细胞毒T细胞系分离了Fas 的配体

(Fas ligand,Fasl),从而建立了 Fas/Fasl细胞凋亡信息传递系统.

结构分析证实Fas是I型跨膜蛋白,

分子量45KD,属肿瘤坏死因子(TNF)和神经生长因子(NGF)受体家族.

Fasl是1种分子量约40KD

的II型跨膜蛋白,属TNT家族成员.

Fas含死亡结构域(DDs),与Fas 发生反应的蛋白是 Fas 死亡

结构域相关蛋白(Fas associated death domains,FADD),Fas与FADD通过DDs形成2聚体而相互作用.

FADD N末端称为死亡效应结构域(death effector domain),该结构负责将凋亡信号传递至Caspase-8,

使之活化,从而启动Caspase级联反应,细胞产生凋亡 .

研究发现,持续局灶性脑缺血可诱导Fas编

码基因变异形成了sFas,其缺乏跨膜蛋白,sFas与Fas竞争结合Fasl,Fas与可溶性Fasl(sFasl)结合,

发出凋亡信号,并传递至细胞核内,调节基因转录而诱导靶细胞凋亡;

而sFas缺乏跨膜蛋白的死亡结

构域(DDs),不具生物活性,sFas与Fasl结合后,信号无法通过细胞膜传递至胞内,从而抑制凋亡.

7 立早基因(immediateearlygenes,IEGs)C-fos与C-jun

IEGs是脑缺血后快速而短暂表达的1簇基因的统称,现研究较多的有c-fos

和c-jun家族.

c-fos

和c-jun表达的蛋白是转录调控因子,通过形成2聚体的形式结合在靶基因的DNA相关序列即AP-1

位点,影响靶基因的表达,参与信号转导.

c-fos在脑缺血中是起保护还是损伤作用1直有争议.有实

验表明N-乙酰基-O-甲基多巴胺(N-acety-O-methyldopamine,NAMDA)在缺血刺激下能上调c-fos的表

达,CA1神经元c-fos的早期表达增加能上调存活基因的表达而产生神经保护作用.

局部脑缺血后,

C-fos蛋白通过上调神经营养因子发挥神经保护作用,抑制C-fos蛋白的表达能使脑梗面积增大.也有

实验表明局部脑缺血能诱导大脑皮质中C-fos和C-jun蛋白的大量生成,且与神经功能的缺陷程度成正

相关.使用血管紧张素受体拮抗剂能降低脑中C-fos和C-jun蛋白的表达,改善脑缺血损伤的恢复.

C-fos与C-jun均为原癌基因,正常情况下,C-fos与C-jun在神经元中仅呈极低水平表达,而脑缺

血与再灌注后即被快速而短暂地诱导表达.

研究表明,大鼠大脑中动脉阻断1h后,C-fos与C-jun mRNA

表达开始升高,主要位于半暗带区和梗死周边的正常组织.

其促凋亡的机制可能为:其产物fos,jun

经亮氨酸拉链,联合为杂合2聚体,即转录因子AP1,特异性与DNA上AP1结合位点结合而启动晚

期效应基因的转录,从而促进凋亡.也有学者认为C-fos 的表达具有神经保护作用.

在脑缺血研究中

发现,将形成梗死灶的缺血中心区C-fos不表达或轻微表达,而半暗区C-fos表达明显.

全脑缺血中,

能耐受缺血的齿状回C-fos表达最快,最明显,而海马区(尤其CA1区)表达弱且延迟,说明其早期表

达对缺血后细胞的存活具重要神经保护作用.

3,展望

脑缺血后神经元凋亡受1系列基因调控.

神经元凋亡可能是通过启动细胞自身内部的死亡机制发

生的.

我们前期研了大鼠脑缺血再灌注后Fas,TNFR1,p5

3,c-Myc,P-ERK,P-p38等在海马区的表达

及Bcl-2过度表达对其的影响.

结果发现,大鼠脑缺血再灌注后,Fas,TNFR1,p5

3,c-myc,P-p38

蛋白在海马CA1区及CA3区均有表达,但CA1区强于CA3区;P-ERK在CA1区及CA3区亦均有表达,

但CA1区弱于CA3区;

Bcl-2基因过度表达可明显减弱Fas,TNFR1,p5

3,c-myc,P-p38蛋白的表达,

增强P-ERK蛋白的表达,说明Bcl-2除主要通过线粒体内在途径发挥其抑凋亡作用外,还通过其他途

径如死亡受体外在途径(TNFR1,Fas)及DNA损伤机制等抑制凋亡.

目前有关脑缺血后神经元凋亡相关基因的表达研究越来越多且渐趋深入,随着对凋亡基因研究的

深入及对凋亡机制的阐明,用干预基因表达的方法治疗脑缺血是可以预见的具有潜力和突破性的手段.