干细胞

人胚胎干细胞系的成功建立，掀起了干细胞（StemCell）研究的热潮。在过去的10多年中，无论是与干细胞相关的基础研究还是应用研究都取得了长足进展。有些学者甚至认为干细胞的研究开创了生物医学的新时代。与此同时，人们对干细胞的理解也不断地加深。为此扼要介绍有关干细胞的一些基本概念。1干细胞“干细胞”一词最早出现于19世纪，1896年，Wilson第1次用到“干细胞”这个名词，专指寄生性蠕虫，如蛔虫生殖系统的早期细胞。当时人们对干细胞的理解仅限于能够产生子代细胞的一种较原始的细胞。目前认为，干细胞是指功能上具有自我更新(self-renewal)能力，同时具有分化（differentiation)能力的一类细胞（Weissmanetal.2001）。自我更新能力和分化潜能是干细胞的2个基本特征。干细胞的自我更新有两重意义，一是细胞的分裂潜能，如一般人的体细胞只能在体外分裂50～60个代次，而干细胞可以远远超越这一极限，且在分裂的同时维持干细胞的特征。二是克隆形成能力即增殖产生更多的与自身相同的干细胞。分化潜能是指干细胞分化为不同细胞类型的能力，不同种类的干细胞其分化潜能有所不同。因此，可以把干细胞定义为具有自我更新能力和分化潜能的细胞群体。根据分化潜能的不同，干细胞可分为全能干细胞（totipotentstemcell）、多潜能干细胞(pluripotentstemcell)、多能干细胞（multipotentstemcell）和单能干细胞（unipotentstemcell）。根据来源不同，干细胞又可分为胚胎干细胞（embryonicstecell）和成体干细胞（adultstemcell）。成体干细胞还可以根据干细胞的组织来源分为造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞等。因此，成体干细胞又称组织干细胞（tissuestemcell）。一般认为，胚胎干细胞属多潜能干细胞，也有人认为是一种全能干细胞。组织干细胞属多能或单能干细胞。随着干细胞研究的深入，对干细胞定义的理解及其分类也将会更加确切。干细胞的增殖速度通常很慢，它的分裂表现为2种方式：对称性分裂和不对称性分裂。前者用于干细胞自身数目的扩增，而后者除了自我更新外，还产生分化的细胞。早期分化的细胞称为祖细胞或前体细胞（progenitorcell），它们可以大量扩增，并进一步分化产生各种不同类型的细胞。这些复杂的过程需要在特定的微环境（niche）中精确调控完成。因此，在体外培养条件下，如何在干细胞传代培养过程中，维持其自身的特性不变，以及如何在体外诱导干细胞向某种类型细胞的定向分化，一直是干细胞研究领域中所面临的基本问题。2胚胎干细胞胚胎干细胞是指哺乳动物胚胎发育早期的干细胞，如囊胚（blastocyst）中的干细胞和胚胎发育早期的生殖嵴（gonadalridges）干细胞等。目前建立的胚胎干细胞系主要来源于囊胚中的内细胞团（innercellmass）。人胚胎发育后5～7d形成的结构称为囊胚。囊胚的外表由一层致密的扁平细胞组成，称为滋养层(trophoblast)，它将发育成胚胎的支持组织如胎盘。囊胚的中心为一空腔，称为囊胚腔，腔内的一侧有一团细胞，称为“内细胞团”，约有140个细胞（图1）。组成内细胞团的细胞均为未分化的干细胞，它们可以分裂并分化形成内、中、外3个胚层，每个胚层将进一步分化形成人体的各种组织和器官。例如外胚层能分化为皮肤、神经系统等，中胚层能形成血液、心脏和肌源于内细胞团的体外培养的胚胎干细胞，在一定条件下，也可以分化为3个胚层的各种细胞，如果将其移植到小鼠的囊胚中，还可继续发育产生子代的个体。但是，如将它们植入子宫中，由于不能分化出胎盘等胚外组织，所以无法发育成正常个体。因此，胚胎干细胞应属于多潜能干细胞。真正涵义的哺乳动物全能干细胞只有卵裂早期的细胞（一般不超过16个细胞的卵裂球）。植入子宫后，它们不仅可以分化产生3个胚层中的各种类型的细胞，而且还能发育成胎盘组织，最终产生子代个体。然而，随着研究的进展，人们发现虽然直接把胚胎干细胞移植到子宫内，不能发育成子代个体，但在体外培养的条件下，却能够分化形成精子和卵子，并在子宫中进一步发育成新生的个体。因此，从这个意义上讲，目前很多人认为，胚胎干细胞是一种全能干细胞。3成体干细胞成体干细胞又称组织干细胞，几乎在成体各种组织中都发现了相关的干细胞。如存在于人体骨髓中的造血干细胞可以分化成红细胞，血小板和淋巴细胞等10种以上的血细胞，骨髓间充质干细胞也具有分化为成骨细胞、软骨细胞等多种细胞的能力。通常称这类干细胞为多能干细胞，其分化的潜能是有限的，一般局限于分化产生同一胚层的细胞类型。单能干细胞仅能分化产生1种或几种类型的细胞，如小肠上皮中的干细胞，能够分化为小肠上皮细胞等4种细胞，神经干细胞可分化产生神经元、寡突胶质细胞和星形胶质细胞等3种细胞，而肝脏胆管中的干细胞仅能产生肝细胞和胆管细胞。这显然与各种干细胞所存在的部位和它们所承担的功能相关。由于多数的组织干细胞还没有发现其确切的表面标志分子，因而也就很难识别和纯化，这就给成体干细胞的研究与应用带来很大的困难。如人的造血干细胞是研究最为深入，应用最早（骨髓移植实质上就是造血干细胞的移植）的成体干细胞，但至今尚不能纯化，也很难在体外扩增。如能解决这些问题，将会极大的推进医学的进步。4胚胎干细胞系的建立细胞建系是指将分离的生物体的某种细胞，在体外特定条件下，长期稳定的传代培养。细胞系多用于科学研究以及生物工程领域。1981年，英国科学家Evanshe和Kanfman等首次在体外建立了小鼠胚胎干细胞系。这项研究为基因打靶技术的建立打下了基础，开创了哺乳动物功能基因组学研究的新途径，并于2007年获诺贝尔医学或生理学奖。1998年，美国威斯康星大学Thomson教授等又成功地建立了人胚胎干细胞系（图1）。这一成果极大地推进了人胚胎干细胞发育分化机制研究的发展，开辟了生物医学研究的新领域。那么人胚胎干细胞系是如何建立的呢？Thomson研究小组从14个由体外受精的人胚胎发育而来的囊胚中分离出了内细胞团，并以照射过的不分裂小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层，在特定的培养基中进行培养，最后得到了5株具有正常XY或XX核型的人的胚胎干细胞系，分别称为H1、H7、H9、H13和H14。同年，约翰霍普金斯大学Gearhart教授领导的小组采用了与Thomson小组不同的方法，从5～9周龄流产胎儿的生殖嵴（gonadalridges）中分离出了原始生殖细胞，以小鼠胚胎成纤维细胞系STO细胞作为饲养层，最终得到了5株具有正常核型和分化潜能的胚胎干细胞系，称为胚胎生殖嵴干细胞。无论是从体外发育的囊胚中分离出的内细胞团，还是从早期流产胎儿中分离出的原始生殖细胞，在适当的培养条件下都可以获得特性非常相似的胚胎期干细胞系。当然，这些细胞需要经过一系列的鉴定，确认它们是具有自我更新能力和分化潜能的正常干细胞。然而，从小鼠胚胎干细胞建系到人胚胎干细胞建系，历经17年之久，可见寻找合适的干细胞培养条件和培养方法需要进行大量艰苦的探索性研究。2008年，在人胚胎干细胞建系10年后，又完成了大鼠胚胎干细胞建系工作。除此之外，应用核移植法或称体细胞克隆技术也可以建立人胚胎干细胞系，即取出人体细胞的细胞核，用显微注射技术移植到去核的卵母细胞中，在体外发育成囊胚，取其内细胞团建立人胚胎干细胞系。这一技术的最大优点是可以建立成人自己的胚胎干细胞系。5诱导性多潜能干细胞基于人胚胎干细胞系的建立和克隆羊的成功，2001年Haseltine提出了再生医学（regenerativemedicine）的概念，这一旨在将治疗性克隆技术与人胚胎干细胞的制备相结合，利用体外构建的自身组织与器官使患者得以康复的新的治疗理念，极大地促进了干细胞体外定向分化及其相关领域研究的发展（图2）。然而，在这一革命性的医学理念的实施，需要人的卵细胞及发育早期的胚胎（囊胚），从而引发了伦理问题的争论。诱导性多潜能干细胞（inducedpluripotentstemcells，简称iPSC）建系技术的建立，使人们有可能避开应用人的卵细胞以及其所涉及到的颇有争论的伦理问题，使干细胞在理论和应用研究上又迈进了一大步。日本京都大学教授山中伸弥（Yamanaka）实验室分析了卵细胞中有可能使已经分化的体细胞核发生逆转的24种基因，经过10年的努力，终于在2006年证明，只需向小鼠的成纤维细胞中转入4种基因（Oct4，Sox2，c-myc和KLF4）就可以诱导产生性质与胚胎干细胞类似的iPSC。1年后，3个实验室同时应用类似的技术，将人成纤维细胞等体细胞诱导产生了人的iPSC。2009年我国的周琪等2个实验室证明了植入小鼠囊胚中的iPSC可以发育成小鼠，进一步表明了iPSC与胚胎干细胞极其相似，极大地推进了iPSC的理论与临床应用研究。