Simone
你对分子生物学的基因克隆很不熟悉啊。基因克隆的最后一步双酶切法，是用来检验插入到表达质粒中的目的基因是否正确的一种简易方法（但是准确率不如直接测序）。构建完成的表达质粒是环形DNA，如何进行双酶切检验举例如下。比如，你的目的基因大小为2.3kb，两端有BamHI和EcoRI酶切位点，在目的基因中的1kb处有一个HindII酶切位点，插入到一个3.7kb的质粒中。那么如何通过双酶切检验呢？
首先，用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到 线性的质粒DNA 和 你的目的基因DNA ，分别为3.7kb和2.3kb。跑电泳得到两条带，分别在3.7kb处和2.3kb处。如果用BamHI和HindII进行双酶切，得到 线性的质粒DNA加一部分目的基因的DNA片段 和 目的基因的剩余DNA片段 ，分别为5kb（3.7kb+2.3kb-1kb）和1kb。跑电泳得到两条带，分别在5kb处和1kb处。如果用HindII和EcoRI进行双酶切，得到 线性的质粒DNA加一部分目的基因的DNA片段 和 目的基因的剩余DNA片段 ，分别为4.7kb（3.7kb+1kb）和1.3kb（2.3kb-1kb）。跑电泳得到两条带，分别在4.7kb处和1.3kb处。如果所有的电泳结果皆符合预期，则该表达质粒构建成功。
以上就是利用双酶切法验证插入到表达质粒中的目的基因是否正确的原理。还是难以理解的话，建议画图。
不说酶切条带，单质粒电泳就有三种状态，超螺旋，开环，线性，迁移速度都不一样，最前面是超螺旋，中间线性，后面是开环。另外电泳只是辅助检测，准确的结果还得测序，你这样的也就四五十块钱就够了
质粒直接电泳，有时会有多条带，原因是其不同形态，比如有超螺旋、单链缺刻、双链缺刻等等。如果提取质量好，超螺旋含量最高，电泳跑最前面，对比分子Marker，会比实际大小跑更前一些。比如本来质粒是5Kb,电泳看起来在3Kb。跑最慢的是单链缺刻，比实际大小还慢，一般含量很小。跑在与实际大小相同位置的是开环质粒，这部分含量会随着时间推移上升。存上一周时间，基本上占主导位置了。用于转染工作时，尽量用新提取质粒，超螺旋含量最高。如果有非超螺旋结构，假如缺刻产生在目标基因处，比部分质粒对转染无效了。用于内切酶检查，就无所谓了。
题主的意思我理解为实验提取的质粒DNA经过电泳后为什么有两条带？
我们平时使用的质粒通常是环状形式存在，但是我们实验中提取到的质粒，由于各种外因干扰，会出现三种状态：线性质粒（提取的时候质粒被破坏了）、环状质粒（正常情况下的质粒）和超螺旋状态的质粒（质粒被超螺旋化）。
因此，实验提取的质粒在进行电泳时，这三种状态的质粒在电泳时，虽然分子量相同，但是在通过琼脂糖凝胶分子筛时的电泳迁移率还是有差别的，迁移率最小的是超螺旋状态质粒，其次是环状质粒，最后是线性质粒。所以质粒经过电泳后会出现两条带，甚至三条带都是正常的。
